产品概览及工作流程:
在分化过程中,MSC会首先在CBB™培养基中被诱导分化为成熟的类多巴胺能神经元细胞。整个分化过程大约需要 14 天(图1)。
图1. 简化的工作流程图(MSC细胞诱导过程中的时间轴及各阶段的形态变化)。在CBB™培养基中培养的MSC可被特异性诱导成中脑底板、
扩增并储存起来,随后成熟为类多巴胺能神经元,为期约14天。
实验数据:
实验结果显示,经过14天CBB™培养基培养诱导的MSC分化成的类多巴胺能神经元可维持中脑的特性(图2,图3)、具有与已经发表的实验方法生成的神经元相同的基因表达谱(图4),并展现出自发性动作电位以及在去极化时释放多巴胺的功能性(图5)。
图2. 成熟 DA神经元的代表性图像。以下图像是在加入CBB™类多巴胺能神经元诱导分化培养基第7天,用人多巴胺能神经元免疫细胞化学试剂盒随附染色试剂而获得的。
大部分表达 TH 的神经元也共表达了 FOXA2。(A)抗 TH(绿色)。(B)抗 FOXA2(红色)及 NucBlue 染色(核 DNA DAPI染色)(蓝色)。(C)抗 TH 与抗 FOXA2
(绿色与红色)的合并图像。
图 3. 人iPSCs的生物学特征鉴定 Fig.3 Biological characterization of hiPSCs. A: hiPSCs express pluripotency markers OCT4, SOX2, SSEA1 and Nanog (immunofluorescence assay).
B: Chromosome G-banding of hiPSCs showing chromosomes at the metaphase (left) and the karyotype(right). C: AP-positive dense cell colonies of hiPSCs.
D: Expression of pluripotency markers detected by RT-PCR and Western blotting.
图4. 关键基因的基因表达谱与通过发表的实验方法而生成的神经元相当(Kriks 分化后第 48 天与 DA 神经元分化后第7天)。
图5. 通过 HPLC 评估分化神经元中的自发性及去极化诱导的多巴胺释放。通过 HPLC 测定自发性及由去极化诱导的多巴胺释放,以评估分化神经元的功能。
收集条件培养基(第 12 至 14 天),测定自发性多巴胺释放。在 37°C 将 DA 神经元在 Hank 平衡盐溶液 (HBSS) 或含有 56 mM Kcl 的 HBSS 中孵育 15 分钟,
可实现去极化诱导的多巴胺释放。分化的 DA 神经元不仅能产生多巴胺(条件培养基),还可通过加入过量 K+ 引起的电压门控刺激释放多巴胺。